Il Museo è ospitato all’interno del seicentesco Seminario Vescovile. Sin dal corridoio è possibile osservare dei dipinti del Settecento provenienti da chiese locali; una saletta è dedicata alle icone di matrice bizantina, tra queste la Madonna dello Zaffiro, la più popolare Madonna delle Grazie. In un'altra sala spiccano la tavola centrinata, proveniente dall'antica cattedrale di Monopoli. In fondo al corridoio si accede si accede alla sala dedicata alla pittura napoletana, con la splendida tela di Paolo Finoglio, la Madonna in gloria tra Sant'Eligio e San Trifone, eseguita come ex voto intorno al 1634.